Address reprint requests to Jae Woo Kim, MD, PhD Department of Ophthalmology, Daegu Catholic University School of Medicine, #33 Duryugongwon-ro, 17-gil, Nam-gu, Daegu 42472, Korea 섬유주는 녹내장에서 방수유출의 조절에 중요한 역할을 하는데, 섬유주의 변성이나 섬유주세포의 감소로 인해 섬유주의 기능이 저하되면 방수유출로의 저항이 증가되어 개방각녹내장이 유발된다.1,2 대부분의 안압하강제는 방수 생성을 감소시켜 안압하강 작용을 나타내지만 프로스타글란딘 제제는 포도막공막을 통한 방수유출을 증가시켜 강력한 안압하강 작용을 나타내어 녹내장의 일차 치료제로 많이 사용되고 있다.3,4 이와 함께 섬유주를 통한 방수유출을 증가시키는 약제에 대해서도 다양한 연구가 시행되어 왔는데5 그중 일산화질소(nitric oxide, NO)가 섬유주를 이완시켜 방수유출을 증가시키면서 안압하강 작용을 나타내는 것으로 알려져 있어6,7 이를 이용한 안압하강 약제가 연구되어 왔다.8-10
최근 개발된 안압하강제인 라타노프로스텐 부노드(latanoprostene bunod, LBN)는 기존에 많이 사용되고 있는 라타노프로스트(latanoprost) 제제에 NO를 결합시킨 약제로서, LBN은 안구 내에서 가수분해되어 라타노프로스트 유리산(latanoprost free acid, LAT)과 butanediol로 환원되어 NO 공여자로서의 작용을 함께 나타내어,11 LBN은 기존 약제들에 비해 우수한 안압하강 효과를 나타낸다는 여러 임상 연구가 보고되어 있다.12-20
NO는 cyclic guanosine monophosphate (cGMP)를 활성화시켜 섬유주를 이완시키는 작용을 나타내는데21-23 LBN은 기존의 포도막공막유출을 증가시키는 LAT에 섬유주를 이완시켜 방수유출을 촉진하는 NO의 작용을 추가하여 이중 작용을 나타낸다고 한다.24,25 따라서 LBN이 섬유주에서 NO를 증가시켜 cGMP를 활성화시킴으로써 방수유출을 증가시키는 작용을 나타낼 가능성이 있으나 아직 실험실 내에서 섬유주의 투과도에 미치는 영향은 자세히 연구되지 않았다. 이에 따라 본 연구에서는 인체의 섬유주세포에서 LBN이 NO의 생성에 미치는 영향과 섬유주의 투과도에 미치는 영향을 LAT와 비교하여 실험적으로 알아보고자 하였다.
대상과 방법
세포배양과 약물처리
본 연구는 대구가톨릭대학교병원 의학윤리심의위원회(IRB)의 승인을 받았고(CR-22-115-L) 헬싱키선언을 따라 시행되었다. 상용의 사람 일차 섬유주세포(Cat. No. 6590, ScienCell, San Diego, CA, USA)를 해동하여 항생제와 10% 우태아혈청이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium 배지를 사용하여 5% CO2배양기에서 배양한 후 충만해지면 1:3의 비율로 트립신 처리하여 계대배양하였다. 배양된 사람의 섬유주세포에 50, 100 μM LBN (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)과 50, 100 μM LAT (Cayman Chemical)에 각각 30분간 노출시켰다. 이때 NO가 섬유주단층세포층의 투과도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 100 μM LBN에 cGMP 저해제인 0.5 mM N-Nitroarginine methyl ester (L-NAME, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 함께 노출시켜 실험을 시행하였다.
MTT assay
세포의 생존에 대한 효과를 알아보기 위해 세포의 생존과 활성도 검사로 이용되고 있는 발색검사의 일종인 MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) assay를 이용하였다.26,27 각 농도의 약물로 30분간 처리한 세포의 배지에 MTT를 각 well당 100 μL씩 투여한 후 4시간 동안 정치배양한 다음 염류용액(phosphated buffered saline [PBS]; Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 씻어낸 후 dimethylsulfoxide를 각 well 당 0.5 mL씩 넣어 10분 이상 흔든 다음 96-well 배양접시에 200 μL씩 옮겨 분광광도계(FLUOstar OPTIMA, BMG labtech, Ortenberg, Germany)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포의 생존 정도는 실험군의 값을 약물처리를 하지 않은 대조군의 값으로 나누어 백분율로 나타내었다.
Griess assay
섬유주세포에서 일산화질소의 생성은 Griess assay를 이용하여 배지에서의 nitrite 생성량을 측정하였다.28 각각의 약물에 노출시킨 세포의 배지에 동량의 Griess 반응액(Sigma-Aldrich)를 섞은 후 96-well plate에 옮겨 spectrophotometer로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준치를 구하기 위해 sodium nitrite (Sigma-Aldrich)를 단계적으로 희석하여 사용하였다.
섬유주단층세포층의 투과도 측정
섬유주세포를 트립신 처리한 후 12-well의 Transwell (Corning, No.3460, Tewksbury, MA, USA)의 내측 chamber (insert diameter 12 mm, pore size 0.4 mm)에 2×104 cells/mL의 농도로 각 well에 고르게 세포를 분주하여 10% 우태아혈청을 포함한 배지로 배양하였다.29-32 역위상차현미경으로 섬유주세포가 단층으로 충만하게 자란 것을 확인한 후 혈청에 포함된 단백질 등의 영향을 배제하기 위하여 1% 우태아혈청을 포함한 배지로 교환한 다음 각 약물에 30분간 각각 노출시킨 후 투과도 검사를 시행하였다. 내측 chamber에 자라고 있는 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 50 mM carboxyfluorescein (Sigma-Aldrich)에 노출시켰다. 노출 2시간 후 Transwell을 통하여 외측 chamber로 투과된 carboxyfluorescein의 농도를 532 nm에서 spectrofluorometer (Fluostar Optima, BMG Labtech, Offenburg, Germany)로 측정하여 백분율로 나타내었다.
섬유주단층세포층의 투과도를 측정하기 위한 또 다른 방법으로 trans-endothelial electrical resistance (TEER)를 측정하였다. 섬유주세포를 12 well의 Transwell insert에 각각 2×104 cells/mL 농도로 분주한 다음 세포가 충만하게 배양된 것을 확인한 후, 각각의 약물에 30분간 노출시킨 후 epithelial voltohmmeter (EVOM2, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 TEER 값을 측정하였으며그 결과를 net value (Ω cm2)로 기록하였다.33,34
결 과
LBN이 섬유주세포의 생존에 미치는 영향
30분간 약물에 노출시킨 후 세포의 생존에 미치는 영향을 측정하기 위해 시행한 MTT assay에서 약물에 노출시키지 않은 대조군에 비해 LBN과 LAT는 각각 세포의 생존에 유의한 영향을 미치지 않았다(all p>0.005) (Fig. 1). 따라서 아래의 투과도 실험의 결과는 세포 수의 변화에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.
LBN이 섬유주세포의 NO 생성에 미치는 영향
약물에 노출시키지 않은 대조군에 비하여 100 μM LBN은 배지에서의 nitrite 농도를 유의하게 증가시켰다(p=0.029) (Fig. 2). 100 μM LBN에 L-NAME를 함께 처리한 경우 LBN 단독으로 처리한 경우에 비해 nitrite의 농도가 유의하게 감소하였다(p=0.041). LBN과 LAT를 50 μM씩 처리한 경우를 비교해보면 NO 생성에서 유의한 차이를 보이지 않았으나(p=0.191), LBN과 LAT를 100 μM씩 처리한 경우를 비교해보면 LBN이 LAT에 비해 유의하게 nitrite의 농도를 증가시켰다(p=0.040).
LBN이 섬유주단층세포층의 투과도에 미치는 영향
약물에 노출시키지 않은 대조군에 비하여 50, 100 μM LBN은 carboxyfluorescein의 섬유주단층세포층의 투과도를 106.1%, 111.4%로 각각 유의하게 증가시켰으나(p=0.010, 0.001) LAT는 유의한 영향을 미치지 않았다(Fig. 3). 100 μM LBN에 L-NAME를 함께 처리한 경우 100 μM LBN 단독으로 처리한 경우에 비해 투과도가 7.8% 감소하였다(p=0.001). LBN과 LAT를 처리한 경우 투과도를 비교해보면 50, 100 μM 농도 모두에서 LAT에 비해 LBN이 유의하게 투과도를 증가시켰다(p=0.018, 0.001).
LBN이 섬유주단층세포층의 저항도에 미치는 영향
약물에 노출시키지 않은 대조군의 저항도는 63.02 Ω cm2였으며 이에 비하여 100 μM LBN을 처리한 경우의 저항도는 53.01 Ω cm2로 15.89% 감소하였다(p=0.047) (Fig. 4). 50 μM LBN을 처리한 경우 저항도는 58.48 Ω cm2로 7.21% 감소하였으나 통계적으로 유의하지는 않았으며(p=0.235), 50 또는 100 μM LAT는 대조군에 비하여 저항도의 유의한 차이를 보이지 않았다.
100 μM LBN에 L-NAME를 함께 처리한 경우 100 μM LBN 단독으로 처리한 경우에 비해 저항도는 10.58% 감소하였으나 통계적으로 유의하지 않았으며(p=0.162), LBN과 LAT를 처리한 경우의 투과도를 각각 비교해보면 50, 100 μM 농도 모두에서 LAT에 비해 LBN이 농도가 증가할수록 저항도를 감소시키는 경향을 나타내었으나 통계적으로 유의하지는 않았다(p=0.444, 0.073).
고 찰
기존의 동물실험에서 프로스타글란딘에 NO를 결합시킨 약제의 안압하강 효과가 보고된 이후11,35 최근 개발된 LBN은 기존의 녹내장 안압하강제들에 비해 우수한 안압하강 효과를 나타내었다는 여러 임상 연구 결과들이 보고되어 왔다.12-20 이러한 LBN의 우수한 효과는 동물실험을 통해서는 LAT에 의한 포도막공막유출을 촉진하는 작용과 섬유주를 통한 방수유출을 증가시키는 NO의 이중 작용에 의한 것으로 여겨져 왔지만,11 LBN이 인체 내에서 섬유주의 방수유출에 미치는 영향은 섬유주세포를 이용한 실험실 내 연구에서는 아직 자세히 밝혀지지 않았다. 이에 따라 본 연구에서는 배양한 인체 섬유주세포를 이용하여 실험실 내에서 LBN이 섬유주를 통한 방수유출에 미치는 영향을 LAT와 비교하여 알아보았다.
본 연구의 결과에서 LBN은 섬유주단층세포층의 투과도를 농도에 비례하여 증가시켰으며 저항도를 감소시켰으므로 LBN이 섬유주를 통한 방수유출을 증가시키는 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이에 비해 LAT는 투과도에 유의한 영향을 미치지 않았는데 기존의 몇몇 연구에서 라타노프로스트가 섬유주에서 세포외기질을 감소시키거나 기질금속단백질분해효소를 증가시켜 섬유주를 통한 방수유출을 촉진시킨다는 보고도 있었으나4,36 이에 대해서는 아직 논란의 여지가 많다고 볼 수 있으며 본 연구의 결과에 따르면 LAT는 섬유주를 통한 방수유출에는 유의한 영향을 미치지 않았으므로 LAT가 섬유주를 통한 방수유출에 미치는 영향은 적을 것으로 생각된다. 따라서 LBN은 LAT에 비해 섬유주를 통한 방수유출의 증가를 추가적으로 나타낼 수 있으므로 조금 더 우수한 안압하강 효과를 나타낼 것으로 여겨진다.
이러한 LBN의 추가적인 안압하강 효과는 섬유주에 작용하는 NO에 의한 것으로 여겨지며37 본 연구서도 LBN이 NO의 생성을 증가시키는 것으로 나타났다. NO는 cGMP를 통하여 작용을 나타내는데21-23 본 연구에서 cGMP 제해제로 작용하는 L-NAME를38,39 함께 노출시킨 결과 LBN에 의한 섬유주단층세포층의 투과도 증가와 저항도 감소가 상쇄되었다. 따라서 LBN은 섬유주에서 NO의 생성을 증가시켜 cGMP를 통해 섬유주를 이완시켜 방수유출을 촉진시키는 작용을 나타낸다고 볼 수 있겠다.
비록 본 연구가 실험실 내에서 섬유주단층세포층을 이용한 투과도를 비교 연구한 결과이기는 하지만 섬유주세포를 이용한 이전의 실험실 내 연구에서 LBN이 LAT에 비해 유의하게 섬유주를 이완시켰다는 결과를24 함께 고려해보면 LBN은 포도막공막유출과 섬유주유출을 함께 촉진하는 이중 작용을 나타내며, 이에 따라 기존의 라타노프로스트 제재보다 임상적으로 우수한 안압하강 효과를 나타낸다는 이전 임상 연구들의 결과들을 뒷받침한다.
또한 NO는 안압하강 효과뿐만 아니라 산화스트레스를 감소시키며 시신경혈류를 증가시켜 신경보호 효과를 나타낸다고 알려져 있는데,40 이에 대한 LBN의 작용에 관해서는 향후 더 자세한 연구가 필요할 것이다.
결론적으로 섬유주세포에서 LBN은 라타노프로스트에 의한 포도막공막유출 증가와 더불어 NO에 의한 섬유주유출을 함께 증가시킴으로써 기존의 라타노프로스트 제제보다 조금 더 우수한 안압하강 작용을 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.
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