Address reprint requests to Jae Woo Kim, MD, PhD Department of Ophthalmology, Daegu Catholic University School of Medicine, #33 Duryugongwon-ro 17-gil, Nam-ku, Daegu 42472, Korea 당뇨망막병증(diabetic retinopathy, DR)은 당뇨병에서 흔히 나타나는 미세혈관의 합병증으로서 고포도당은 주요한 발병 요인이다. DR에서 조직병리학적 변화가 일어나기 전에 망막 미세혈관의 세포고사가 먼저 나타난다고 알려져있다.1-3 여러 종류의 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)가 당뇨에 의한 합병증의 발현에 관여하는데 그중 MMP-9이 미세혈관세포의 세포고사를 유발하는 것으로 보고되어 있다.4-7 MMP-9의 활성은 주로 tissue inhibitor of MMP (TIMP)-1에 의해 조절되는데8 DR이 있는 경우 망막의 MMP-9 발현이 증가되고 TIMP-1의 발현은 감소된다.9,10
호모시스테인(Homocysteine, Hcy)은 다양한 안질환을 유발하는데,11 당뇨 환자의 혈청에서는 Hcy의 농도가 증가되어 있으며 DR의 발병과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다.12,13 Hcy는 망막혈관내피세포의 기능을 저하시킬 뿐만 아니라 MMP-9과 TIMP-1의 균형을 파괴하는 것으로 보고되었으며, 이는 포도당의 농도가 높을수록 더 현저하게 나타난다.14,15
녹내장의 경우 안압의 조절에 중요한 역할을 하는 섬유주에서 다양한 종류의 MMP가 발현되며 섬유주에서 방수 유출을 조절하는 데 있어서 MMP에 의한 세포외기질의 대사조절이 중요한 역할을 한다.16,17 당뇨병은 녹내장의 발병과 관련이 있을 수 있는데18 당뇨 환자의 방수 내 포도당의 농도가 증가되어 있을 뿐만 아니라19 원발개방각녹내장 환자의 방수에서 Hcy의 농도가 높게 나타나는 것으로 보고되어 있다.20,21 녹내장의 경우 방수유출이 감소하는 기전의 하나로 섬유주세포의 숫자가 감소하여 방수유출이 감소할 수 있는데,22 당뇨 환자의 혈청과 방수에서 Hcy의 농도가 높게 나타나며 포도당농도도 높게 나타나므로 이에 의해 MMP-9을 활성화시켜 섬유주세포의 손상과 세포고사를 유발할 가능성이 있으나 섬유주세포에서 Hcy가 MMP-9의 발현과 세포고사에 미치는 영향은 아직 자세히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 사람의 섬유주세포에서 Hcy가 MMP-9의 발현과 세포고사에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
대상과 방법
세포배양 및 약물처리
본 연구는 대구가톨릭대학교병원 의학윤리심의위원회(IRB)의 승인을 받았고(승인번호: CR-22-023-L) 헬싱키선언에 따라 시행되었다. 상용의 사람 일차 섬유주세포(Cat. No. 6590, ScienCell, San Diego, CA, USA)를 해동하여 항생제와 10% 우태아혈청이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지를 사용하여 5% CO2배양기에서 배양한 후 충만해지면 1:3의 비율로 트립신 처리하여 계대배양하였다. 배양된 사람의 섬유주세포를 트립신처리하여 1일간 배양접시에 부착시킨 후 고농도의 포도당을 함유한 DMEM 배지(20 mM, high-glucose [HG])와 저농도의 고농도 포도당을 함유한 DMEM 배지(5 mM, low-glucose [LG])를 이용하여 3일간 배양하였으며, 이때 각각의 LG와 HG에 100 μM Hcy (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 함께 노출시켰다.
MTT assay
Hcy가 세포의 생존에 미치는 영향은 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma, St. Louis, MO, USA) assay를 이용하여 조사하였다.23,24 각각의 약물을 처리한 세포의 배지에 MTT를 각 well당 100 mL씩 투여한 후 4시간 동안 정치배양한 다음 염류용액(phosphated buffered saline, PBS)으로 씻어낸 후 dimethylsulfoxide (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 각 well당 0.5 mL씩 넣어 96-well plate에 옮겨 spectrophotometer (Fluostar Optima, BMG labtech, Offenberg, Germany)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포의 생존 정도는 실험군의 값을 약물처리를 하지 않은 대조군의 비로 나누어 백분율로 나타내었다.
섬유주세포에서의 MMP-9, TIMP-1 단백의 활성을 측정하기 위한 western blot
단백질 추출에는 RIPA buffer (Thermoscientific, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다. Cell lifter (Corning, Acton, MA, USA)로 세포를 모아 원심 분리하여 상층액을 모아 -80°C에 보관하였다. 단백질량은 BCA protein assay reagent kit(Thermoscientific, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며 정량한 샘플을 같은 양으로 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 전기영동한 후 Xcell Surelock (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 니트로셀룰로오스 막(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 1시간 transfer한 다음 막 차단 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 1시간 동안 정치배양하였다. Goat Anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated된 각각의 이차 항체(Santacruz, Dallas, TX, USA)를 막 차단 용액에 1:3,000으로 희석하여 처리하고 상온에서 1시간 반응시킨 다음, 항체를 반응시킨 막을 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermoscientific, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 Gel Doc XR+ (Bio-rad, Hercules, CA, USA)로 단백의 발현양을 확인하였다. 이때 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal standard로 사용하였다.
세포고사의 측정
Hcy가 섬유주세포의 세포고사에 미치는 영향을 알아보기 위하여 상용의 kit (TACS Annexin V-FITC apoptosis detection kit, R & D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 fluorescein isothiocyanite-labeled Annexin V/propidium iodide (PI) 이중염색을 한 후 유세포분석을 시행하였다.25 섬유주세포를 24-well 배양접시에 분주하여 부착시켜 HG와 LG의 두 가지 배지를 이용하여 100 μM Hcy를 3일간 노출시켰다. 트립신으로 분리한 세포를 원심분리하여 PBS로 세척한 다음, 5 μL의 annexin V와 1 μL의 PI를 100 μL의 세포부유물에 추가하여 15분간 실온에서 정치배양한 후 400 μL의 완충액을 넣어 섞어 유세포분석기(Gallios, Beckam Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 이때 fluorescence emission은 530 nm와 575 nm 이상으로 하였다.
결 과
Hcy가 섬유주의 생존에 미치는 영향
LG 배지에 Hcy를 추가한 경우는 추가하지 않은 경우에 비하여 섬유주세포의 생존에 유의한 영향을 미치지 않았다(p=0.078) (Fig. 1). HG 배지에 Hcy를 추가한 경우에는 추가하지 않은 경우에 비하여 섬유주세포의 세포의 생존이 유의하게 감소되었다(p=0.036). 따라서 LG 배지에 비하여 HG 배지를 사용한 경우, Hcy에의 추가 노출 여부에 상관없이 섬유주세포의 생존이 유의하게 증가되었으므로 세포 생존의 증가는 HG에 의한 것임을 알 수 있었다.
Hcy가 TIMP-1과 MMP-9 단백의 활성에 미치는 영향
LG 배지에 Hcy를 추가한 경우는 추가하지 않은 경우에 비하여 TIMP-1 단백의 활성에 유의한 영향을 끼치지 않았다(p=0.671) (Fig. 2). HG 배지에 Hcy를 추가한 경우에는 TIMP-1 단백의 활성을 증가시키는 경향을 나타내기는 하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(p=0.094). MMP-9 단백의 활성은 LG 배지에 Hcy를 추가한 경우가 추가하지 않은 경우에 비하여 유의한 차이를 보이지 않았으며(p=0.264) (Fig. 3), HG 배지에 Hcy를 추가한 경우에도 MMP-9 단백의 활성에 유의한 영향을 끼치지 않았다(p=0.413).
Hcy가 섬유주세포의 세포고사에 미치는 영향
Annexin V/PI 이중 염색을 하면 세포고사를 나타낸 세포는 annexin에만 염색된다. HG 배지에 Hcy를 추가하지 않은 경우 세포고사를 나타낸 세포는 0.26%였으며, 추가한 경우에는 0.19%로 나타나 두 군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다(p=0.437) (Fig. 4). HG 배지에서 전체적인 세포고사는 0.225%로 나타나 Hcy가 섬유주세포의 세포고사에 미치는 영향은 적은 것을 알 수 있었다.
고 찰
DR의 발병에 있어서 고혈당증이 중요한 요인으로 여겨지며 또한 Hcy의 대사장애도 중요한 요인의 하나로 여겨지고 있다. 이전의 임상연구에서 Hcy의 농도 증가가 DR의 위험 요인이며 이러한 농도의 증가는 망막혈관내피세포의 기능장애와 망막신경섬유층의 소실을 유발한다고 하였다.11-13,26-27 HG 조건하에서 시행한 세포배양 실험에서 MMP-9의 활성이 증가되며28-29 이에 따라 세포고사가 유발되는데, 고농도의 Hcy와 HG의 조건에서는 상승 작용을 나타내어 세포고사를 더욱 촉진하며 이러한 Hcy와 HG의 상승작용은 망막혈관내피세포뿐만 아니라 섬유아세포에서도 나타난다.15,30 DR에서 MMP-9이 활성화되면 망막혈관내피세포의 세포고사를 유발하며,7,10 이러한 MMP-9의 활성 증가는 MMP-9의 조직저해제인 TIMP-1의 활성 감소가 동반되면서 나타난다.9,10,31
당뇨 환자의 방수 내 포도당농도가 증가되어 있으며 원발개방각녹내장 환자의 방수에서 Hcy의 농도가 높게 나타난다.19,20 항상 방수와 접촉하고 있으며 내피세포의 성질을 가진32 섬유주세포에서도 높은 Hcy의 농도와 관련하여 세포고사가 유발될 가능성이 있을 것이며, 이는 당뇨 환자에서 녹내장을 유발하는 요인의 하나가 될 수 있을 것이다.
이를 확인하기 위해서 시행한 본 연구의 결과에서 LG 조건하에서 Hcy는 세포의 생존에 영향을 미치지 않았으며, HG 조건하에서 Hcy의 추가는 세포의 생존을 감소시켰다. 또한 HG 조건하에서 Hcy의 추가는 TIMP-1 단백의 활성을 증가시키기는 하였으나 통계학적으로 유의하지 않았으며, MMP-9 단백의 활성을 감소시키기는 하였으나 역시 통계학적으로 유의하지 않았다.
따라서 망막혈관내피세포와는 달리 섬유주세포에서는 HG의 조건에서 Hcy의 증가가 TIMP-1의 감소와 MMP-9의 증가에 따른 세포고사를 유발할 가능성은 적을 것으로 생각된다. 이러한 결과는 유세포분석의 결과에서 HG의 조건과 HG에 Hcy를 추가한 경우를 비교하였을 때 세포고사의 정도가 유의한 차이를 보이지 않았을 뿐만 아니라 전체적인 세포고사의 유발 정도도 적게 나타난 것으로도 확인할 수 있다.
이와 같이 섬유주세포의 세포고사가 적게 나타나는 이유로 생각해볼 수 있는 것은 섬유주세포에서 MMP-9과 TIMP-1의 발현 자체가 매우 적게 나타나므로33,34 HG와 Hcy의 조건하에서도 망막혈관내피세포에서 볼 수 있는 세포고사의 기전인 MMP-9의 증가 효과가 적게 나타나기 때문으로 여겨진다. 또한 고농도의 Hcy가 망막혈관내피세포에서 작용하는 기전의 하나인 산화스트레스가14 전방에 존재하는 다양한 항산화 기전에 의해 억제되므로35 실제 인체 내에서 섬유주세포에 미치는 영향은 적을 것으로 생각된다. 당뇨와 녹내장의 관련성에 대해서는 다양한 의견이 있으며 그 연관성은 아직 확실하지 않다. 본 연구의 결과에 따르면 DR의 요인의 하나로 생각되는 Hcy는 망막 미세혈관에는 위험요인으로 작용할 수 있으나 섬유주세포에 미치는 영향은 적게 나타났으므로 DR에서 증가한 Hcy가 녹내장을 유발하는 요인으로 보기는 어려울 것이다.
본 연구에서는 Hcy가 주로 작용하는 MMP-9의 발현과 세포고사에 미치는 영향을 조사하였는데 섬유주세포에서는 다양한 MMP가 발현되므로 MMP-2를 비롯한 다른 종류의 MMP가 미치는 영향에 대해서는 보다 자세한 연구를 요한다.36 또한 HG와 Hcy의 조건에 장기간 노출되었을 경우 미치는 영향에 대해서도 향후 보다 자세한 연구가 필요할 것이다.
결론적으로 망막혈관내피세포와는 달리 섬유주세포에서는 Hcy가 TIMP-1과 MMP-9 단백의 활성, 그리고 세포고사의 정도에는 유의한 영향을 미치지 않았다. 따라서 섬유주세포에서 Hcy가 세포고사에 미치는 영향은 제한적일 것으로 생각된다.
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